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原代细胞的分离和制作

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浏览:次 2017-05-22 22:47:11

原代细胞的分离和制作 原代细胞的分离和制作 人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密,不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖,即便采取1mm3的组织块,也只有少许处于周边的细胞可能生存和生长,若需获得大量细胞,必须将现有的组织块充分散开,使细胞解离出来,常采取的方法以下:1、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料,最简单的方法是采取1000r/min的低速离心10分钟,若悬液量大,可适当延长离心时间,但速度不能太高,延时也不能太长,以免挤压或机械损伤细胞,离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次,用培养基洗1次后,调剂适当细胞浓度后再分瓶培养,若选用悬液中某些细胞,常采取离心后的细胞分层液,由于,经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中构成不同层,这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章 人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密,不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖,即便采取1mm3的组织块,也只有少许处于周边的细胞可能生存和生长,若需获得大量细胞,必须将现有的组织块充分散开,使细胞解离出来,常采取的方法以下:
1、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料,最简单的方法是采取1000r/min的低速离心10分钟,若悬液量大,可适当延长橡胶材料拉伸试验机离心时间,但速度不能太高,延时也不能太长,以免挤压或机械损伤细胞,离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次,用培养基洗1次后,调剂适当细胞浓度后再分瓶培养,若选用悬液中某些细胞,常采取离心后的细胞分层液,由于,经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中构成不同层,这样可根据需要高温拉伸试验机收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。
2、实体组织井盖试验机材料的分离方法
对实体组织材料,由于细胞间结合紧密,为了使组织中的细胞充分分散,构成细胞金属材料试验机悬液,可采取机械分散法(物理裂解)和消化分离法。
(1)机械分散法
所取混凝土磨耗试验机材料若纤维成份很少,如脑轮毂轴承试验机组织,部份胚胎组织可采取剪刀剪切、用吸管奏乐分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用9号针),使细胞通过针头压200t压力试验机出,或在不锈钢纱网内用钝物压挤(经常使用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速,但对组织机械损伤大,而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成份少的软组织。
(2)消化分离法
组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状),利用酶的生化作用和非酶的化学作用进1步使细胞间的桥连结构松动,使团块膨松,由块状变成絮状,此时再采取机械法,用吸管奏乐分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡,使细胞团块得以较充分的分散,制成少许细胞群团和大量单个细胞的细胞动力电池短路试验机悬液,接种培养后,细胞容易贴壁生长。
1、酶消化分离法
酶消化分离法常采取胰蛋白酶和座垫冲击试验机胶原酶,其分离方法以下:
(净水机水压试验机1) 胰蛋白酶分散技术
胰蛋白酶(重锤橡胶低温脆性试验机简称胰酶)是广泛利用的消化剂。胰蛋白酶是1种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,拉力材料试验机主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开,在经常使用的蛋白酶中由于产品的活力和纯nbs耐磨试验机度不同,对细胞的消化能力也不同,胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、纸箱边压试验机无机盐离子、pH和消化时间的长短等。
①细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如 乳腺、滑膜、子宫、纤维赘瘤、肿瘤组织等就无效,但如果与胶原酶适用,就可以增加其对组织的分离作用。
②酶的活力 市售的胰蛋白酶,万能伺服试验机其活力都经过测定而有效,但配制时必须新鲜,需保存在低温冰箱中,消化时的p微机控制90度剥离试疲劳强度试验机验机H和温度都要适合,否则会影响活力,细胞的分散直力学试验机接与酶的活力有关,婴儿床往复冲击试验机终究使用活力为1:200或1:250,56℃pH8.0时活力最强。
该酶为粉剂,收藏时要防潮,室内温度不宜太高,保存时间不能太长,若粉剂结团块,说明该部份受潮或失效。
③酶的浓度 胰蛋白酶1般采取的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但塑料哑铃试验机遇到弹簧疲劳试验机难消化的组织时,浓度可适当提高,消化时间适当延长。微机控制电液伺服压剪试验机浓度高对细胞有毒性,而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可增进细胞的增殖,若培养液中加入血清,其少许胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。
④温度 1般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强,但由于对细胞有侵害而不能被采取,常使用的温度为37℃,通常在37℃进行消化比室温作用快。
⑤pH pH8~p自行车弹簧试验机H9是胰蛋白酶活力适合范围,但随碱性的增加其活力也随之减少,活性强分散快,细胞也容易被消化下来,消化分离细胞时PH只能选用真三轴试验机7.6~8.0之间,否则对细胞有损伤。
⑥无机盐离子 若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时,可以产生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采取无钙镁离子的PBS配制。
⑦消太阳能电弹簧拉伸卧式试验机池片焊带剥离试验机化时间 如果细胞消化时间太长,可以侵害细胞的呼吸酶,从而影响细胞的代谢,1般消化时间为20分钟为好,冷消化时使用低浓度消化液,于4℃过1晚也可。
分离方法以下:
①过1晚冷消化 将获得的组织用Hanks液洗3次,剪成碎块大小为4毫米左右,用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织,再加入0.25%的胰蛋白酶,摇匀后放4℃过1晚,第二天再用Hanks液洗涤,弃去上清,共洗2~3次,然后,加入少许营养液奏乐分散,细胞计数,按适当的浓度分瓶培养。
②屡次提取消化法 屡次提取消化法有以下3种:
热消化屡次提取--将剪碎塑料环刚度试验机的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟,然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液,按适合的浓度分瓶培养,然后将留下的未完全消化泡沫板压力试验机的组织按上述方法操作,再消化提取细胞。
冷消化屡次提取--方法同上,只是消化温度为4℃。
先热消化后冷消化--将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散,we100b液晶数显式万能试验机制成悬液,剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过1个晚上,第二天再提取细胞,分散成悬液,分瓶培养轮轴实物疲劳试验机。
(2) 胶原酶(Collagenase)消化法
胶原酶是1种从细菌中提取出来的酶,对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织和癌组织,它对细胞间质有较好的消化作用,对细胞本身影响不大,可以使细胞与胶原成份脱离而不受伤害。该酶分离效果好,即便有焊缝拉伸试验机钙、镁离子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培养液配制,即操作简便又可提高细胞成活率,终究浓度200u/mL或0.1~0.3mg/塑料管爆破试验机mL.此酶消化作用和缓,无需机械振荡,但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验本钱。
经过胶原酶消化后的上皮组织,由于上皮细胞对酶有耐受性,可能有1些上皮细胞团块还没有被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更旋转轴扭转试验机容易生长,因此没必要要再进1步消化处理。
鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性(见表4⑴)和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间(小时)有差异(见表4⑵),和二者价格不等,有人采取胶原酶与胰蛋白酶并用,同时还可加透明质酸酶(对细胞表面糖基有作用),采取二者的联合消化作用,对分散大鼠和兔肝、癌组织非常抗拉抗压试验机有效。
表4⑴ 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别
项 环块式摩擦试验机目胰蛋白酶胶原酶消化特性适用于消化软组织适用于消化纤维多的组织用 量0.01%~0.5%0.1~0.3mg/mL(200u/mL)消化时间0.5~2小时(低温碎石冲击试验机小块)1~12小时p汗渍色牢度试验机H8~96.5~7.0作用强度强烈和缓细胞影响时间太长有影响无大影响血清、钙、镁离子有影响无影响表4⑵ 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间(小时)(0.5~1cm3)
酶 种 类较 硬 组 织软 组 织4℃ 室 温 37℃4℃ 室 温 37℃胰蛋白酶(0.25%)24~481~61~212~2光缆过滑轮试验机41~20.5~1胶原酶(200u/mL)2466.51230.25二者联合12~4612~244~1212~246~121~2除上述两种最经常使用的消化酶外,还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋汽车减震器性能试验机白酶、木瓜蛋白酶,最近几年来,还有1种从灰霉菌中提取的液晶显示抗压抗折试验机Pronase新酶分散细胞更佳。
2、atlas紫外老化试验机非酶消化法(EDTA消化法)
EDTA是1种非酶消化物,又称螯合剂或Versene,全名为乙烯2胺4拉链负荷拉次试验机乙酸。经常使用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液,对1些组织,特别是上皮组织分散效果好,该化学物资能与细胞上的钙、镁离子结合构成螯合物,利用结合后的机械力使模似运输试验机细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离,缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状,有团块,常不单独使用,但可与胰卧式插拔寿命试验cmt电子万能试验机机蛋白酶混合使用(1:1或2:1),不但动态静态机械载荷试验机利于细胞脱壁又利于细胞分散,可下降胰皮革耐扰试验机酶的用量和毒性作用。
消化分离法的操作步骤:
(1)剪切 把组织块剪碎,呈1~5mm3大小的组织块。
(2可燃性难燃性试验机)加液漂洗 将碎组织块在平皿(或3角烧瓶)中用无钙镁PBS洗2⑶次(采取倾斜,自然沉降法)。
(3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换1次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜太长。
(4)弃高压防爆仓球形容积耐压力试验机去消化液 采取倾斜自然沉降或低速离心法尽可能木制家具力学综合试慢应力腐蚀试验机验机弃去消化液。
(5)漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入,中断消化反应,采取漂洗法洗2⑶次后,加入完全培养基。
(6)机械分散 采取吸管奏乐或振荡法,使细胞充分散开后用纱网整车道路模拟试验机或3~4层无菌纱布过滤后分瓶马丁耐热试验机培缠绕扭转试验机养,若要求不高可采取倾斜自然沉降5~10分钟,吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
注意事项以下:
(1)组织块必须漂洗2⑶次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
(2)胰蛋白浓度不宜太高,作用时间不能太长,以免毒性作用。
(3)消化后组织不但要尽可能弃去消化液,以免毒性产生,而且动作要轻,以免膨松的细胞随漂洗而丢失。
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